具有热稳定性的NAD +依赖性双链DNA连接酶，在15至75°C的温度下具有活性。

描述

来自高温活性栖热菌的DNA连接酶是一种热稳定的NAD +依赖性双链DNA连接酶，在15至75°C的温度下具有活性。该酶对平端DNA片段没有活性。

产品提供500单位，以及10x反应缓冲液。

                                                                                                                                                                                                                      产品描述

介绍：

Tsc DNA连接酶催化双链DNA结构中相邻3′-羟基和5′-磷酸末端的NAD依赖性连接。与T4 DNA连接酶相反，Tsc DNA连接酶对平末端DNA片段没有可检测的活性。与T4 DNA连接酶不同，Tsc DNA连接酶在4 bp和2 bp的内聚末端在最佳温度条件下仅表现出最小的连接活性。Tsc DNA连接酶对RNA靶没有活性。Tsc DNA连接酶是从大肠杆菌菌株中分离和纯化的，该菌株带有一个质粒，该质粒具有克隆的DNA连接酶基因，该基因来自冰岛分离的嗜热细菌水管致黑栖热菌（1,2）。 连接酶的半衰期在91°C下为26分钟（3）。该酶的反应温度范围很广，下限约为15℃，上限由DNA底物的解链温度（Tm）决定。该酶在pH范围为7-9的各种DNA聚合酶缓冲液中也有活性。在最佳条件下，与其他常见的热稳定连接酶相比，Tsc DNA连接酶的寡核苷酸连接速率和程度要高得多（4,5）。

 

应用范围：

Tsc DNA连接酶是需要高温，高严格双链DNA连接的应用的理想酶.Tsc DNA连接酶可

用于：

用于扩增DNA靶标的连接酶链反应（LCR）（6-8）。

用于突变分析的寡核苷酸连接测定法（OLA）（9-10）。

重复扩增检测（11）仅用于研究遗传异常，例如三核苷酸重复，而不用于诊断目的（例如易碎X，亨廷顿病）。

来自重叠寡核苷酸的基因合成（12）。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               存储：

储存和稀释缓冲液：20 mM Tris-HCl，50 mM KCl，0.1 mM EDTA，0.1％Triton X-100（v / v），1 mM二硫苏糖醇（DTT），50％甘油（v / v） ，pH 7.6（25°C）。 Tsc连接酶在–15°C至-25°C下保存时稳定。

                                                                                                                                                                                                              反应条件：

1 x反应缓冲液（已提供10 x）20 mM Tris-HCl，20 mM KCl，10 mM MgCl2、0.1％Nonidet P40（v / v），0.5 mM NAD，1 mM DTT，pH 7.5（ 25°C）。

浓度和单位定义

浓度10 U /μl。一单位Tsc DNA连接酶可在45°C下于1分钟内催化1μgBstEII消化的λDNA的cos位点的50％连接。

                                                                                                                                                                                                                                       应用协议：

寡核苷酸连接的反应方案：

解冻下面列出的组件，然后将其放在冰上。在设置反应之前，先短暂涡旋并离心所有试剂。在置于冰上的微量离心管中设置反应成分：

成分                     容量                 最终浓度

反应缓冲液（10x）         2.0μl               1 x

寡核苷酸1                 Xμl                1-30nM

寡核苷酸2                 Xμl                1-30nM

模板DNA                   Xμl                0.1ng

Tsc DNA连接酶             0.5μl              5U

加入无菌水                高达20.0μl 

总量                      20.0μl 

典型的温度曲线为：94°C 2分钟，94°C 30秒，45-65°C 3分钟，并重复最后两个温度进行30个循环。 99°C 10分钟。                                                                                                                                                                                                                                                                                             活性测定：

用于单位定义的酶测定法是用BstII消化的λDNA的cos位点的连接。

成分                     容量                   最终浓度

反应缓冲液（10x）         2.0μl                 1x

λDNA（已消化BstEII）     Xμl                   1μg

Tsc DNA连接酶            稀释系列 

加入无菌水               高达20.0μl 

总量                     20.0μl 

在45°C孵育1-15分钟。在干冰/乙醇浴中停止反应。在琼脂糖凝胶上分析之前，在65°C下孵育10分钟（融解未连接的cos位点）

通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色测定结果。

                                                                                                                                                                                                              质量控制：

如下所述，分析每批活性 ssDNA连接酶的活性和污染活性。

                                                                                                                                                                                                               缺少DNA核酸内切酶：

在25μl反应中，将0.25μg超螺旋pBR322 DNA与递增量的Tsc DNA连接酶在37°C下孵育16小时。大于100 U的Tsc DNA连接酶显示pBR322 DNA的超螺旋结构没有松弛。

在37℃和64℃下，在25 µl反应中用Tsc DNA连接酶诱导加入0.25 µgλ-DNAEco RI / HindIII片段16 h。 100 U的Tsc DNA连接酶显示未改变条带模式。

                                                                                                                                                                                                              缺少核酸外切酶：

将越来越多的Tsc DNA连接酶在50μl含有[3H]标记的DNA的测试缓冲液中于37°C和64°C孵育4小时。显示无核酸外切酶活性的酶量> 100U。

缺少核糖核酸酶：

根据制造商规程，使用了Ambion的RNaseAlertTM实验室测试套件检测RNase活性。 1小时后，在37°C孵育X U Tsc DNA连接酶后，未检测到RNase活性。