无动物参与的皮肤致敏试验方法

ADRA试剂盒

　　ADRA（Amino acid Derivative Reactivity Assay，氨基酸衍生物反应法）是应用了N-(2-(1-naphthyl) acetyl)-L-cysteine【NAC】和α-N-(2-(1-naphthyl) acetyl)-L-lysine【NAL】的化学品皮肤致敏试验方法，该方法无动物参与，是动物皮肤致敏试验的替代方法，符合OECD TG442C（经济合作与发展组织化学品 TG442C测试准则）。

◆原理

皮肤致敏是由致敏物质与蛋白结合形成复合物（KE1）开始的，该复合物通过致敏物质与蛋白中的半胱氨酸的巯基或赖氨酸的氨基的共价结合所得。ADRA试验利用NAC（半胱氨酸衍生物）和NAL（赖氨酸衍生物）替代蛋白，通过NAC、NAL和待测物质的反应来预测待测物质与蛋白的结合性。

ADRA试验通过将NAC、NAL溶液与待测物溶液混合，在25°C下反应24小时，然后用HPLC法对反应溶液中残留的NAC和NAL的浓度进行定量，从而对待测物质的皮肤致敏性进行评估。

◆优点

●　灵敏度高：在相对长的波长下（281 nm）检测，可防止待测样品和亲核试剂的共洗脱。

●　沉淀少：ADRA试验所需反应物的浓度仅为DPRA法的1%，可避免沉淀的产生。

●　重复性好：在HPLC分析前，通过添加终止液（2.5％TFA）来终止反应，因此检测的可重复性好。

●　高通量：ADRA试验使用96孔板和多通道移液器，可在短时间内测定多个样品。

◆试剂盒组成

试剂名称	容量	包装
NAC	10 mL用	2瓶
NAL	10 mL用	2瓶
NAC 缓冲液 (pH 8.0) （预混合）	300 mL用	2瓶
NAL 缓冲液 (pH 10.2) （预混合）	300 mL用	2瓶
0.01 mol/L EDTA溶液	1 mL	2瓶

◆使用方法

　　用水将预混合缓冲液溶解，再将NAC和NAL溶于其中，然后在96孔板与待测物反应24小时后，通过HPLC即可进行分析。

　　预混缓冲液、NAC和NAL都已经按照反应所需的量分装好，只需进行溶解即可用于ADRA试验。

◆操作视频

●  缓冲液的制备

●  Day1 反应溶液的制备 

●  Day2 反应的终止

◆其他需要用到的试剂·实验器材

试剂

产品编号	产品名称	规格	包装
204-02743	Trifluoroacetic Acid 三氟乙酸	和光特级	25 mL
015-08633	Acetonitrile 乙腈	高效液相色谱仪用	3 L
217-01031	Ultrapure Water 超纯水*	超微量分析用	1 L
016-00346	Acetone 丙酮* *	试剂特级	500 mL
043-07216	Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜	试剂特级	500 mL

* 蒸馏水或更高级别的水（ADRA试验需要使用金属含量低的水。）

* * 请勿在被测物质溶于水或乙腈时使用。

※ 需要用苯乙醛 (CAS RN^® 122-78-1)作为阳性对照化合物。

 

实验器材

●　电子天平：精确到0.1 mg

●　微量移液枪：量程为2～10 µL、10～100 µL和100～1000 µL的3种移液枪

●　12道移液器：量程为50～150 µL

●　HPLC系统：配套96孔用遮光自动进样器，以0.3 mL/min流速进样

●　UV检测器：二极管阵列检测器（PDA检测器）或吸光度检测器（281 nm）

●　HPLC柱：Wakopak^® Core C18 ADRA Φ3.0 × 150 mm（粒径：3.6 μm）（产品编号：233-63991）

●　HPLC柱：或同类型产品

●　pH计：pH可读取到±0.01，并配套校准用缓冲液

●　恒温箱：温度可设定为25℃

●　96孔板

●　500 mL PE瓶

●　试管混合器

●　微孔板封板膜：岛津GLC封板膜（产品编号：568-RES001）或同类型具有高密封性和耐溶剂性的产品

●　微孔板振荡器

●　微孔板离心机

※	ADRA中用到的所有容器或器具（HPLC组件除外），要求使用PP或PE制的一次性用品。金属离子的混入会使NAC二聚化从而导致无法正确进行评估。

◆产品列表

产品编号	产品名称	规格	包装
296-80901	ADRA Kit ADRA试剂盒	for Skin Sensitisation Test 皮肤致敏检测用	1 kit

◆相关产品

ADRA专用色谱柱

◆相关应用

皮肤致敏试验替代法ADRA应用实例：使用Wakopak^® Core C18 ADRA色谱柱对"ADRA"中常见化合物进行分析