高存活率细胞冻存液

CryoScarless^® DMSO-Free

CryoScarless^® DMSO-Free是一款不含蛋白和DMSO，适用于多种细胞的细胞冻存液。各种细胞在解冻后具有很高的培养活率，且维持了干细胞的多分化性（未分化状态）。

※　本产品仅供科研，不可用于科研外其他用途。

◆关于含有DMSO冻存液的问题

DMSO作为普通细胞冷冻保护成分常被添加到冻存液中，但同时也是对人体有害的成分，且极易被皮肤吸收。除具有细胞毒性外，如同下列论文所述，是影响细胞分化的因子之一。因此，为获得更精确的实验结果，无DMSO的细胞保存是必须的。

●　使用DMSO将人骨髓白血病细胞株HL-60分化为粒细胞。¹

●　使用DMSO将小鼠间充质干细胞分化为心肌细胞。 ²

●　使用含有DMSD的冻存液冻存人ES细胞发现未分化标记Oct-4的表达降低。 ³

参考文献

1. Jiang, G., et al., Int. Immunopharmacol., 6 (7), 1204～1213 (2006).

2. Young, D. A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 322 (3), 759～765 (2004).

3. Katkov, I. I., et al., Cryobiology, 53 (2), 194～205 (2006).

◆特点

●　不含血清和蛋白，因此不受白蛋白和球蛋白等蛋白的影响。

●　不受DMSO毒性和蛋白影响，可安全且高活率地冻存细胞。

●　大部分细胞在冻存后复苏，存活率可达90%以上。

●　已有人/小鼠的正常细胞、肿瘤细胞株、干细胞等各种细胞的冻存应用。

●　冻存后可维持干细胞的分化性能。

●　同样适用于无血清培养。

●　经无菌测试确认不含细菌、真菌与支原体污染。

●　本产品可在4°C下长期保存。（有效期2年）。

※　使用台盼蓝处理CryoScarless保存的细胞时，请务必清洗细胞。

◆应用实例１

大鼠间充质干细胞分化能力

确认使用本产品冻存的大鼠间充质干细胞在复苏后的分化能力，并与未冻存组以及10% DMSO保存的细胞进行比较。结果显示，使用本产品冻存的细胞皆维持良好的分化性能。

大鼠间充干细胞的存活率

检测使用本产品冻存（1周）的大鼠间充质干细胞在复苏后的存活率以及6 h后的存活率，并与10% DMSO保存的情况进行比较。本产品无论是在刚复苏（0 h），还是贴壁后（6 h）皆显示更高的存活率。

◆应用实例2

使用CryoScarless^® DMSO-Free简单冻存后的小鼠ES细胞

实验方法：

将小鼠ES细胞（FKHR＋/＋）在明胶包被的96孔板上于37°C培养48 h后，进行简单地冻存。吸走培养基并用PBS清洗，然后分别添加10%DMSO/培养基，或CryoScarless^® DMSO-Free，在-80°C下保存。24 h后迅速复苏，添加加热至37°C的培养基，在37°C下继续培养。6 h后使用光学显微镜观察相衬图像。

结果：

可观察到在10%DMSO/培养基中保存的小鼠ES细胞在复苏后活细胞减少（左图），而在CryoScarless^® DMSO-Free中保存的小鼠ES细胞状态得到改善，可观察到大部分的活细胞。

讨论：

在对多个转基因克隆的培养板一起进行冻存时（简易冻存），使用CryoScarless^® DMSO-Free更加方便。利用CryoScarless^® DMSO-Free进行冻存，存活细胞更多，更易于未分化小鼠ES细胞的传代培养（在一定细胞密度下每2天传代一次），并可顺利进行分化实验。

数据提供

熊本大学发育医学研究所 干细胞部门 组织干细胞领域 田村洁美老师

小川峰太郎老师（组织干细胞领域教授：中间），田村洁美老师（右起2）与研究室成员

◆应用实例3

对于人牙髓来源间充质干细胞的体内实验，CryoScarless^® DMSO-Free拥有更出色的冻存能力

日本牙科大学生命牙学部 发育、再生医科讲座 中原贵教授

生命牙科学讲座 望月 真衣 助教

Establishment of xenogeneic serum-free culture methods for handling human dental pulp stem cells using clinically oriented in-vitro and in-vivo conditions.

Stem Cell Research & Therapy,, 9：25, (2015).

背景

由于再生医学不断普及，因此急需确立可安全地培养从患者获得的间充质干细胞的方法。近年来，通过牙科治疗从拔牙的牙组织（牙髓）中获得的间充质干细胞，显示比骨髓干细胞高3~4倍的高增殖性，且没有伴随染色体异常的细胞变化。而且牙髓干细胞拥有与骨髓干细胞相同的多分化性能。由于在体外培养可大量增殖，灵活利用低癌变和成瘤风险的牙髓干细胞，对于确保医疗安全性的再生医学来说是一个极具吸引力的选择。

作为再生医学中必不可少的“细胞冻存”，已经证明CryoScarless^® DMSO-Free（BioVerde公司）是一款优秀的细胞冻存液。换言之，使用该细胞冻存液冻存的人牙髓干细胞拥有与未经冻存培养的牙髓干细胞相同的增殖能与多分化能力，且未发现染色体异常。

本文着眼于牙髓干细胞活跃的增殖能力，并证实了CryoScarless^® DMSO-Free不会影响细胞增殖能力。

方法及结果

从20~37岁成人拔下来的智齿分离牙髓细胞并进行无血清培养，培养至传代数为1时使用CryoScarless^® DMSO-Free冻存。3个月后再次培养冻存的细胞，传代数到3时进行以下的细胞评价。同时，对未经冻存的牙髓细胞也进行了相同的评价。

使用相差显微镜观察细胞形态，确认纺锤形的成纤维细胞形态没有发生变化（图-1）。根据增殖曲线分析的结果，经过12天的培养，呈现一致的细胞增殖模式，两者间在统计学上的没有显著差异（图-2）。另外，通过Bromodeoxyuridine（BrdU）进行细胞分裂能力分析的结果显示，可观察到对数生长期内大量的BrdU阳性细胞，细胞数在统计学上没有显著差异（图-3）。

图-1 人牙髓干细胞的相差显微镜图像

无论CryoScarless^® DMSO-Free冻存（左）还是未经冻存（右）的细胞都呈现出相同的成纤维细胞样形态。

图-2 人牙髓干细胞增殖曲线分析

细胞培养期间，未发现两者在统计学上的显著差异。

图-3 人牙髓干细胞在对数生长期内的BrdU分析

可观察到大部分细胞摄入BraU（绿）（左），未发现两者的BraU阳性细胞数在统计学上的显著差异（右）。

结论

除了本文中报告的细胞增殖能力评价之外，使用CryoScarless^® DMSO-Free冻存的牙髓干细胞不仅维持了成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的多分化能力，也能维持向免疫缺陷小鼠的皮下移植并引起硬组织形成的能力。并且该产品并不影响干细胞的特性。

另外，值得注意的是，使用CryoScarless^® DMSO-Free冻存的牙髓干细胞即使长期培养至传代数为10后仍然保持染色体的二倍体和正常核型，大量培养的细胞中也没有发现染色体异常。

在再生医学中必不可少的“细胞冻存”中，作为冷冻保护剂使用的Dimethyl sulfoxide（DMSO）可能会有细胞毒性和引起意外的细胞分化，因此，我们十分期待能够确立一个像该产品一样的无DMSO的细胞冻存体系。

本报道中使用易于获得的牙髓来源间充质干细胞，研究了CryoScarless^® DMSO-Free对干细胞特性的影响，并确认了使用该产品冻存的细胞与未经冻存的牙髓干细胞拥有相同的细胞特性。因此，CryoScarless^® DMSO-Free在间充质干细胞基础研究以及临床前研究，甚至是将来的再生医学领域中，有望成为一款可以提供安全且高预测性数据和治疗成果的细胞冻存液。

中原贵教授（前排右），望月真衣助教（前排左）与研究室成员

◆实际应用的细胞和冻存效果

* -80°C冻存3个月，复苏后24 h

◆操作方法概要

1. 将培养细胞放入离心管，离心并去掉上清。

2. 按照5×10⁵～5×10⁶ cells/mL添加本产品，并制成细胞悬液，每个冻存管分装1 mL。

3. 放入－80℃超低温冰箱中冻存。

4. 将在上一步中保存的细胞放入37°C恒温水浴槽中，快速晃动使细胞解冻，融化后放入适当的培养基（10 mL）中并离心清洗。

※长期保存请置于液氮罐中保存。

◆产品列表

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可检测细胞温度的荧光探针

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