α-葡萄糖苷酶活性抑制检测试剂盒的开发
和光纯药工业株式会社 试剂化学品研究所 松井泰子
摘要
Wako开发了含有保证酶活性的α-葡萄糖苷酶的"α-葡萄糖苷酶活性抑制检测试剂盒"（以下均称为"试剂盒"）。与"LabAssay™ 葡萄糖检测试剂盒"配套使用，可以用于检测食品等所含成分α-葡萄糖苷酶的抑制作用。试剂盒中的α-葡萄糖苷酶以二糖（蔗糖和麦芽糖）作为反应底物可以保证降解活性，并且被认为可用于测定α-葡糖苷酶抑制活性（IC50）值。以下将对试剂盒的开发经过及其特点进行阐述。
1．开发的背景
近年来，日渐丰富的膳食生活中，肉食品摄入量的增加以及膳食不均衡和营养过剩，导致了糖尿病，肥胖和血脂异常等生活习惯病，另外代谢综合征的发展也日益严峻。1）
特别是糖尿病患者的数量呈上升趋势，根据日本2012年的国家健康和营养调查推算，约有950万人被严重怀疑患有糖尿病，大约1,100万人有患糖尿病的可能性 （糖尿病潜在人群）。
治疗糖尿病临床使用的药物之一就有α-葡糖苷酶抑制剂。淀粉被淀粉酶分解生成麦芽糖等二糖，α-葡萄糖苷酶可分解这些二糖，生成葡萄糖，从而提高血液中的血糖值。因此，通过抑制α-葡萄糖苷酶可减少葡萄糖的生成量并抑制血糖的升高。目前，研究者们正致力于从各种各样的植物中提取α-葡萄糖苷酶抑制物质，并将其应用于抑制血糖值上升的食品中。
目前为止，有若干关于计算α-葡糖苷酶抑制剂的IC50值步骤的报告，但是却没有检测试剂盒之类的商品售卖。此外，哺乳动物小肠来源的α-葡糖苷酶产品很少，其中一部分甚至是无法保证活性值的产品。
因此，定量检测α-葡萄苷酶抑制活性，且具有良好重复性具有一定难度。随着研究人员对可用于定量检测α-葡萄糖苷酶活性抑制作用试剂的需求的增加，在此背景下，Wako开发了本试剂盒。
2．开发的经过
在介绍"试剂盒"的开发过程之前，先说明一下用于计算"LabAssay™ 葡萄糖检测试剂盒"的IC50值的检测原理（图1）。
LabAssay™ 葡萄糖检测试剂盒的检测原理：当显色溶液作用于样本时，样本中的葡萄糖会因显色剂中变旋酶的作用，迅速从α型转换为β型。β-D-葡萄糖在葡萄糖氧化酶（GOD）的作用下被氧化，同时产生过氧化氢。产生的过氧化氢在共存的过氧化物酶（POD）作用下，与显色试剂中的苯酚和4-氨基安替吡啉发生定量氧化缩合，产生红色色素。通过检测红色色素的吸光度，可定量检测样本中的葡萄糖浓度。
图1．LabAssay™ 葡萄糖检测试剂盒的检测原理
· 基质浓度的研讨
本来GOD仅与β-D-葡萄糖反应，但由于其对麦芽糖也具有弱特异性，因此即使背景上升，也可能无法准确的评价抑制作用。因此，要在检测IC50值的基础上探讨最佳的麦芽糖浓度。麦芽糖和显色试剂反应30分钟后，在浓度为18.5mmol/L以下时，空白吸光度变为0.1以下，因此采用浓度18.5mmol/L以下作为候选浓度（表1）（制备方法参照图3）。
接下来，研究浓度为18.5mmol/L以下的麦芽糖中酶活性的结果，维持酶活性2小时以上的基质浓度为18.5mmol/L，因此麦芽糖的最终浓度定为18.5mmol/L。（图2）
表1．麦芽糖浓度的研讨
|
麦芽糖浓糖（mmol/L） |
0 |
7.4 |
18.5 |
37 |
74 |
|
吸光度（A505） |
0.036 |
0.057 |
0.099 |
0.183 |
0.337 |
图2．酶反应曲线
· 根据酶试剂降低偏差的研讨
试剂盒中含有的酶试剂是从大鼠小肠来源的刷状缘膜中提取后，通过离心处理得到的最适成分的悬浊液。若粒子粒径大，会迅速沉淀，在收集时会导致测量值产生波动。因此，为了防止试剂盒中酶试剂的迅速沉淀，采用减小粒子粒径的制造方法，使测量值不会产生波动。表2显示了使用阿卡波糖作为抑制剂的三次实验结果（制备方法参照图3）。
表2．阿卡波糖的IC50值
|
基质 |
IC50值（μg/mL） |
CV值（%） |
|
麦芽糖 |
0.10 |
1.8 |
|
蔗糖 |
1.28 |
0.9 |
图3．试剂盒操作步骤
基质液和酶稀释剂等的详细制备方法请参考产品附带的使用说明书。
3．试剂盒操作步骤
在"试剂盒"的基质（麦芽糖，蔗糖）溶液中，加入连续稀释后的检测样本（α-葡糖苷酶抑制剂）溶液以及 "试剂盒"中的α-葡萄糖苷酶悬浊液。在37℃下反应后，在沸水浴中加热使反应终止，用"LabAssay™ 葡萄糖检测试剂盒"定量检测游离的葡萄糖，并计算出样本的IC50值（图3）。
4．结语
本试剂盒的开发使α-葡萄糖苷酶抑制剂的IC50值的测定成为可能。期待该试剂盒在今后的各种功能性食品的开发和探索中给与一臂之力。
参考文献
| 1） | 森川敏生：科学研究費助成事業 研究成果報告書，課題番号24590037，研究期間2012 ~2014．"Search for new metabolic syndrome therapeutic candidates from Thai natural medicines" |
| 2） | 厚生労働省：平成24 年国民健康・栄養調査（2012）. |
◆相关产品
α-葡萄糖苷酶活性抑制检测试剂盒
试剂盒的构成
酶试剂（α-葡萄糖苷酶）………………………… 1mL×2
缓冲液（马来酸/顺丁烯二酸二钠）… 50 mL用×2
基质1（D-（+）-麦芽糖）……………. 20mL用×2
基质2（蔗糖）………………………………… 20mL用×2
阳性对照（阿卡波糖）……………………..…..100 mg×1
<试剂盒以外所需的器具・器材>
● LabAssay™ 葡萄糖检测试剂盒. ［产品编号. 298 – 65701］
● 96孔透明微孔板
● 酶标仪（505nm吸光Filter）
● 微量移液器
● 恒温槽（37℃）
产品列表
|
产品编号 |
产品名称 |
规格 |
包装 |
|
297-78601 |
α-Glucosidase Inhibitory Activity Assay Kit |
食品分析用 |
96次用 |
α-葡萄糖苷酶活性抑制检测试剂盒
葡萄糖定量用试剂盒
|
产品编号 |
产品名称 |
规格 |
包装 |
|
298-65701 |
LabAssay™ Glucose LabAssay™ 葡萄糖检测试剂盒 |
细胞生物学用 |
1000次用 |