用HPLC法进行快速分析 其二

和光纯药工业 大阪研究所 上森仁志

前篇报道中，介绍了笔者利用以下方法实现HPLC的快速分析：①用高性能填充剂（平均径：3μm等）填充的短柱；②使用反相填充剂时缩短烷基链（例如C₁₈→C₈）。①由于无需变动各成分间的分离系数，所以可以实现快速分析；②则是可以特异性减少疏水性化合物的停留。这些都是在填充剂方面下工夫减少分析时间。本篇介绍的柱切技术，则是在HPLC流路系统上安装自动流路切换阀，链接第一柱（预柱）和第二柱（主要柱），在第一柱完成预分离后，再在第二柱进行再分离。流路系统如图1所示。正常情况下第一柱和第二柱会分别使用不同的填充剂，而如果使用同样的填充剂，设定好不同的移动相条件，则可以实现高分离效率。以下以尿中的5-羟基吲哚乙酸（5HIAA）的快速分析为例说明。要检查尿中的5HIAA，监测羟色胺的动态是有效手段，在临床检测领域里使用HPLC进行。使用普通等梯度法和使用柱切技术的分析比较如图2、3所示。使用等梯度法时，尿中的杂物难以完全分离，而且5HIAA洗脱后有不明峰值出现，每个循环的分析时间比较长。与之相反，使用柱切技术时杂物分离状况比较好，分析时间也较短，分析基本在20分钟内完成。这其中的区别在哪里呢？图4里显示了预柱的分离，在设定好的移动相条件下，5HIAA在2分钟左右时被洗脱出，把柱切时间设定在1.4分至2.7分的话，其他洗脱出的成分就不会进入主柱而会从预柱中洗脱出来。另外，导入主柱含有5HIAA的成分，可以用选择性高的条件（此时使用离子对方法：对5HIAA以外的成分也有效果）进行分离，这样色谱图会变得简单，也没有延迟洗脱出的成分，达到分离良好、分析时间短的效果。

因此，柱切技术虽然需要在HPLC装置的系统控制上安装部件，从而对切换自动流路进行控制，但它拥有高选择性分离、可快速完成分析的优点，我们在进行分析时应该更灵活使用。