线粒体(mitochondrion) 是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，线粒体拥有自身的遗传物质和遗传体系，但其基因组大小有限，是一种半自主细胞器。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。最近越老越多的研究发现线粒体在细胞中的作用远远不止”细胞能量站”。它们参与了各种细胞功能调控，与很多人类疾病存在着莫大的联系。包括细胞信号传导、代谢、自噬、衰老和肿瘤发生都与线粒体的质量和活性相关

品名	货号	用途
Mtphagy Dye试剂	MT02	线粒体自噬
线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit	MD01	线粒体自噬检测

品名	货号	用途
mtSOX Deep Red – Mitochondrial Superoxide Detection	MT14	线粒体超氧化物检测
铁离子荧光探针—Mito-FerroGreen	M489	线粒体内二价铁离子检测
Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂	MT05	线粒体内单线态氧检测
MitoPeDPP试剂	M466	线粒体内脂质过氧化物检测

品名	货号	用途
MitoBright IM Red for Immunostaining试剂	MT15	免疫荧光用线粒体荧光染料Red
MitoBright LT Green试剂	MT10	线粒体长效荧光染色（绿色）
MitoBright LT Red试剂	MT11	线粒体长效荧光染色（红色）
MitoBright LT Deep Red试剂	MT12	线粒体长效荧光染色（深红色）

线粒体功能研究

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同仁化学 线粒体简要通路图.pdf

线粒体相关检测试剂

线粒体自噬检测

线粒体自噬
试剂	Mtphagy Dye	Keima-Red
原理	线粒体自噬染料是一种PH敏感的荧光探针，该染料聚集在线粒体中，并由溶酶体的酸性条件而发出荧光	这是一种基于PH感应比值的荧光蛋白。该蛋白在溶酶体中具有比较高的荧光比值（如550 nm/440 nm）。
固定细胞染色	–	–
活细胞染色	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–
染色时间	>30 min	–
Ex/Em	530/700	440,550/620
产品货号	MD01 , MT02	–

线粒体膜电位检测

Membrane potential 线粒体膜电位
试剂	JC-1	TMRM,   TMRE
原理	JC-1是一种被广泛使用的小分子线粒体膜电位探针，依赖于线粒体膜电位在线粒体中聚集，染料伴随聚集过程，荧光从绿色   (530 nm) 变为红色 (590 nm)。当线粒体发生去极化，红/绿荧光强度比值降低。	该试剂是细胞渗透性荧光染料，由于膜电位在完整的线粒体中积累。探针扩散发生在膜电位降低的受损线粒体中。
固定细胞染色	–	–
活细胞染色	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–
染色时间	10- 60 min	30- 60 min
Ex/Em	Monomer:514/529	550/575
	J-aggregation: 585/590
产品货号	MT09	–

线粒体金属离子检测

	Iron ion (Fe2+) 亚铁离子	Calcium ion (Ca2+) 钙离子
试剂	Mito-FerroGreen	Rhod 2-AM
原理	该试剂是一种细胞通透性探针，其积累在线粒体中，并与线粒体中的亚铁离子发生特异性反应，发出绿色荧光。	该试剂是一种细胞通透性探针，该探针积聚在线粒体中，并与线粒体中的钙离子发生特异性反应，发出红色荧光。
固定细胞染色	–	–
活细胞染色	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–
染色时间	30 min	30-60 min
Ex/Em	505/535	553/576
产品货号	M489	R002

线粒体荧光染色

Mitochondria staining 线粒体染色
试剂	MitoBright LT series	MitoTracker series
原理	细胞渗透性荧光染料，基于线粒体膜电位而在完整的线粒体中积累。	细胞渗透性荧光染料，基于线粒体膜电位而在完整的线粒体中积累。
固定细胞染色	–	–
活细胞染色	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–
染色时间	>10 min	15 -45 min
Ex/Em	493/508,547/563, 643/663	490/516~644/665
产品货号	MT10、MT11、MT12	–

Mitochondria staining 线粒体染色
试剂	DsRed	MitoRed	Rh123
原理	一种红色荧光蛋白染料，通过转染试剂与完整的线粒体结合。	细胞渗透性荧光染料，基于线粒体膜电位而在完整的线粒体中积累。	细胞渗透性荧光染料，基于线粒体膜电位而在完整的线粒体中积累。
固定细胞染色	–	–	–
活细胞染色	Yes	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–	–
染色时间	Expression in 8 -12 hrs.	>15 min	>15 min
Ex/Em	558/583	560/580	507/529
产品货号	–	R237	R233

线粒体氧化应激

	Lipophilic peroxide 脂质过氧化物	Singlet oxygen 单线态氧	Superoxide 超氧化物
试剂	MitoPeDPP	Si-DMA	MitoSOX
原理	MitoPeDPP是一种新型荧光染料，由于其具有三苯基膦结构，因此可以穿过细胞膜并在线粒体中聚集。聚集在线粒体内膜上的MitoPeDPP可以被脂质过氧化物氧化而释放出强荧光。	该试剂是一种细胞渗透性荧光探针，积聚在线粒体中，与线粒体中产生的单线态氧发生反应，发出红色荧光。	该试剂是一种细胞渗透荧光探针，积聚在线粒体中，与线粒体中产生的超氧化物反应，发出红色荧光。
固定细胞染色	–	–	–
活细胞染色	Yes	Yes	Yes
活细胞染色后固定	–	–	–
染色时间	> 15 min	> 45 min	> 10 min
Ex/Em	452/ 470	644/ 670	510/ 590
产品货号	M466	MT05	–

引用论文

① H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, N. Saitoh, S. Hino and M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Reports, 2017, 18(9), 2148.
② L. Garcia-Prat, M. Martinez-Vicente and P. Munoz-Canoves, “Autophagy: a decisive process for stemness”, Oncotarget, 2016, 7(11), 12286.
③ M. Bitar, S. Abdel-Halim and F. Al-Mulla, “Caveolin-1/PTRF upregulation constitutes a mechanism for mediating p53-induced cellular senescence: implications for evidence-based therapy of delayed wound healing in diabetes”, Am J Physiol Endocrinol Metab., 2013, 305(8), E951.
④ C. Wiley, M. Velarde, P. Lecot, A. Gerencser, E. Verdin, J. Campisi, et. al., “Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype”, Cell Metab., 2016, 23(2), 303.
⑤ E. Liao, Y. Hsu, Q. Chuah, Y. Lee, J. Hu, T. Huang, P-M Yang & S-J Chiu, “Radiation induces senescence and a bystander effect through metabolic alterations.”, Cell Death Dis., 2014, 5, e1255.
⑥ K. Nishimura, T. Kumazawa, T. Kuroda, A. Murayama, J. Yanagisawa and K. Kimura, “Perturbation of Ribosome Biogenesis Drives Cells into Senescence through 5S RNP-Mediated p53 Activation”, Cell Rep. 2015, 10(8), 1310.
⑦ M. J. Son, Y. Kwon, T. Son and Y. S. Cho, “Restoration of Mitochondrial NAD+ Levels Delays Stem Cell Senescence and Facilitates Reprogramming of Aged Somatic Cells”, Stem Cells. 2016, 34(12), 2840.

-细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。在细胞周期检测中，DNA含量也同样作为重要的分析手段而被广泛应用。通过细胞DNA含量的测定，可计算各细胞周期的百分率，也可通过DNA片段化检测、DNA双染标记等方法检测细胞凋亡。

细胞凋亡、细胞坏死及细胞自噬具有控制细胞生存及死亡的功能，对了解细胞的各种机能非常重要。

细胞衰老的特征

近几年发现了细胞衰老及具有致癌因子的衰老相关分泌表型（SASP）。在干细胞等领域均发现有衰老现象，在各领域的衰老研究受到越来越多的重视。

通过不同指标评估衰老细胞

在不同传代数的WI-38细胞中，使用不同的试剂盒分别评估细胞的SA-ß-Gal活性，线粒体膜电位和细胞代谢情况（葡萄糖和乳酸）。在衰老细胞中，SA-ß-Gal活性增强，线粒体膜电位降低。其上清液中葡萄糖和乳酸的消耗量等代谢指标有所增加。

细胞老化导致相关因素的变化

引用论文

① H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, N. Saitoh, S. Hino and M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Reports, 2017, 18(9), 2148.
② L. Garcia-Prat, M. Martinez-Vicente and P. Munoz-Canoves, “Autophagy: a decisive process for stemness”, Oncotarget, 2016, 7(11), 12286.
③ M. Bitar, S. Abdel-Halim and F. Al-Mulla, “Caveolin-1/PTRF upregulation constitutes a mechanism for mediating p53-induced cellular senescence: implications for evidence-based therapy of delayed wound healing in diabetes”, Am J Physiol Endocrinol Metab., 2013, 305(8), E951.
④ C. Wiley, M. Velarde, P. Lecot, A. Gerencser, E. Verdin, J. Campisi, et. al., “Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype”, Cell Metab., 2016, 23(2), 303.
⑤ E. Liao, Y. Hsu, Q. Chuah, Y. Lee, J. Hu, T. Huang, P-M Yang & S-J Chiu, “Radiation induces senescence and a bystander effect through metabolic alterations.”, Cell Death Dis., 2014, 5, e1255.
⑥ K. Nishimura, T. Kumazawa, T. Kuroda, A. Murayama, J. Yanagisawa and K. Kimura, “Perturbation of Ribosome Biogenesis Drives Cells into Senescence through 5S RNP-Mediated p53 Activation”, Cell Rep. 2015, 10(8), 1310.
⑦ M. J. Son, Y. Kwon, T. Son and Y. S. Cho, “Restoration of Mitochondrial NAD+ Levels Delays Stem Cell Senescence and Facilitates Reprogramming of Aged Somatic Cells”, Stem Cells. 2016, 34(12), 2840.

2012 年，哥伦比亚大学的 Stockwell 教授等人将一种铁依赖性细胞死亡命名为铁死亡 *， 于 2018 年被细胞死亡命名委员会 (NCCD) 报告为程序性细胞死亡之一。 由铁离子依赖性脂质过氧化物的堆积引起的铁死亡已被证实为不同于作为程序性细胞死亡之一的细胞凋亡的细胞死亡途径， 并且作为癌症治疗的新靶点而受到关注。 它还被证实与各种疾病有关，如神经退行性疾病、中风和肝炎（NASH）。 （*S. J. Dixon, B. R. Stockwell et al., Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death., Cell, 2012, 149(5), 1060.） 关于铁死亡如何检测、铁死亡的检测指标、高分文献信息等可详见下文对应干货链接。

通路图

铁死亡通路图下载

各类指标

铁死亡检测各项指标方法及对应实验结果，详见：

干货｜细胞铁死亡（Ferroptosis）——细胞死亡的新模式

实验例

在铁死亡研究中测量谷氨酰胺/谷氨酸水平

众所周知，通过蛋白处理抑制xCT时，会引起铁依赖性细胞死亡，称为“ Ferroptosis”，使用蛋白处理后的A549细胞测定了谷氨酸的释放量和细胞内谷胱甘肽的含量。 蛋白处理过的A549细胞中的谷氨酸释放减少，并且通过抑制胱氨酸的摄取减少了细胞内谷胱甘肽的量。

铁死亡过程中各指标的波动

1. Mon, E. et al., “Regulation of mitochondrial iron homeostasis by sideroflexin 2”, The Journal of Physiological Sciences, 2019, 69(2), 359–373.DOI: 10.1007/s12576-018-0652-2

2. Takashima, M. et al., “Neuroprotective effects of Brazilian green propolis on oxytosis/ferroptosis in mouse hippocampal HT22 cells”, Food and Chemical Toxicology, 2019, 132, 110669.DOI: 10.1016/j.fct.2019.110669

3. Wang, Y. et al., “PM2.5 induces ferroptosis in human endothelial cells through iron overload and redox imbalance”, Environmental Pollution, 2019, 254(A), 112937.DOI: 10.1016/j.envpol.2019.07.105

4. Yambire, K. et al., “Impaired lysosomal acidification triggers iron deficiency, necrotic cell death and inflammation in vivo”, bioRxiv, 2019,DOI: 10.7554/eLife.51031

5. Kagan, V. et al., “Oxidized Arachidonic/Adrenic Phosphatidylethanolamines Navigate Cells to Ferroptosis”, Nat. Chem. Biol., 2017, 13(1), 81.DOI: 10.1038/nchembio.2238

6. Dar, H. et al., “Pseudomonas aeruginosa utilizes host polyunsaturated phosphatidylethanolamines to trigger theft-ferroptosis in bronchial epithelium”, J Clin Invest. 2018, 128(10), 4639-4653.DOI: 10.1172/JCI99490

7. Totsuka, K. et al., “Oxidative stress induces ferroptotic cell death in retinal pigment epithelial cells”, Experimental Eye Research, 2019, 181, 316-324.DOI: 10.1016/j.exer.2018.08.019

8. Fujiki, K. et al., “Blockade of ALK4/5 signaling suppresses cadmium- and erastin-induced cell death in renal proximal tubular epithelial cells via distinct signaling mechanisms.”, Cell Death Differ. 2019, 26(11), 2371-2385.DOI: 10.1038/s41418-019-0307-8

脂质过氧化物检测

更多脂质过氧化物实验例详见：

如何Get铁死亡-脂质过氧化物实验的正确打开方式？

使用共聚焦显微镜观察L929细胞的细胞内脂质过氧化物的变化。实验的详细信息请参照我们公司的网站。

t-BHP: tert butyl hydroperoxide

<数据提供>

日本北里大学药学部

今井浩孝老师，熊谷刚老师

胞内铁离子检测

<检测条件>

Ex: 561nm  Em: 570-620 nm

比例尺：20 μm

谷氨酸、谷胱甘肽等检测

组织样品中的铁离子检测

Iron Assay Kit三大特点

1.经典比色法，操作简单快捷。

2.二价铁和三价铁均可检测。

3.Excel模板自动计算铁浓度。

加标回收实验验证试剂盒准确性

*加标回收率 是指在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。结果越接近100%，说明检测结果越准确。

相关疾病研究

非酒精性脂肪肝

通过铁死亡抑制肝炎

一项使用 NASH 模型小鼠肝脏的研究证实，在脂肪肝开始时，坏死发生在细胞凋亡之前。 在更详细的实验中，报道了铁死亡与坏死中脂肪性肝炎的触发有关，并且在铁死亡抑制实验中几乎可以完全抑制肝炎的发作。

Minoru Tanaka, et al., “Hepatic ferroptosis plays an important role as the trigger for initiating inflammation in nonalcoholic steatohepatitis”, Cell Death & Disease, 2019, 10, 449.

神经退行性疾病

溶酶体疾病与铁死亡之间的关联

在使用神经元细胞的实验当中，证实敲低溶酶体蛋白 Prosaposin 之后诱导了铁死亡，并且诱导了脂褐素形成和活性氧的产生，这两个指标也是衰老的特征。

Martin Kampmann, et al., “Genome-wide CRISPRi/a screens in human neurons link lysosomal failure to ferroptosis”, Nature Neuroscience, 2021, 24, 1020

癌症

通过铁死亡控制癌症免疫

发现免疫疗法激活的 CD8 + T 细胞通过促进脂质过氧化和导致铁死亡来促进抗肿瘤作用。 该过程被发现是通过免疫疗法抑制胱氨酸的摄取和促进肿瘤细胞脂质过氧化的机制。

Weiping Zou, et al, “CD8+ T cells regulate tumour ferroptosis during cancer immunotherapy”, Nature, 2019, 569, 270

铁

认识到铁在地球生命活动和疾病中的重要性

与铁死亡密切相关的铁研究综述。 有关铁动力学、过量铁引起的致癌作用和关联病信息。

名古屋大学大学院医学系研究科　病理病態学講座　生体反応病理学・分子病理診断学　教授　豊國 伸哉, Dojin News, 2017, 162, 1