DH5α感受态细胞-重组克隆表达-分子生物学


英文名称 E.coli DH5α Competent Cells
储存条件 -70℃保存,必须加干冰运输。自收货之日起液氮保存至少一年,-70℃保存至少6个月。
外观(性状) 干冰运输,单加10kg干冰费
单位

本公司生产的DH5α感受态细胞是采用大肠杆菌DH5α菌株经特殊工艺制备得到,可用于DNA的化学转化。使用pUC19质粒检测,转化效率可达108-70℃保存3-5个月转化效率不发生改变。

基因型: supE44△lacU169φ80 lacZ△M15hsdR17 recA1 end A1 gyrA96 thi-1 relA1

特   点: 一种用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷的抑制型菌株。其φ80 lacZ△M15基因的产物可与pUC载体编码的 β-半乳糖苷酶氨基端实现β互补,可用于蓝白斑筛选。

操作方法:(以下操作均按无菌条件的标准进行)

1、将感受态细胞置于冰上融化,以下实验以100ul感受态细胞为例。

2、向感受态细胞悬液中加入需转化的目的DNA,注意目的DNA的体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一,轻轻旋转离心管以混匀内容物,冰浴放置30分钟。

3、将离心管置于42℃水浴中60-90秒,然后快速转移到冰浴中放置2-3分钟,注意不要摇动离心管。

4、向离心管中加入500ul无菌无抗的SOCLB培养基,37℃ 180rpm振荡培养1小时。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。

5、取适量已转化的感受态细胞涂布含相应抗生素的SOCLB平板,37℃倒置培养12-16小时。涂布用量可根据具体实验来调整,如转化的DNA总量较多,可取100ul左右的转化产物涂板;反之,如转化的DNA总量较少,可取200-300ul的转化产物涂板。过多菌液可以抑制细菌生长。如果预计的克隆较少,可通过离心后吸除部分培养液,悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。涂布剩余的菌液可4℃保存,如果次日的转化菌落数过少,可以将剩下的菌液再涂布新的平板。

注意事项:

      1、感受态细胞应保存在-70℃,不可反复冻融,否则其转化效率将会降低。

      2、实验过程中应严格无菌操作,防止其它DNA或杂菌的污染,避免为以后的筛选、鉴定带来影响。

      3、转化时,转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA量过多或体积过大反而会降低转化效率。转化时DNA体积要小于感受态细胞体积的十分之一。

     4、转化率的计算:转化率=产生菌落的总数/铺板DNA总量。

     5、为防止转化实验不成功,可以保留部分连接产物,以重新转化,将损失降到最低。